08 дец PCR analiza, šta je i zašto je popularna?
Real time pcr analiza je termin koji je ušao u svakodnevni život krajnje neočekivano. Šta je real time PCR metoda i zašto se o njoj priča toliko zadnjih par godina?
Vodeći se logikom iza imena to bi trebalo da je PCR u realnom vremenu, ali šta je onda PCR?
PCR predstavlja skraćenicu od polymerase chain reaction, ili reakcija lancane polimeraze. To zapravo znači reakcija lančanog, sukcesivnog, umnožavanja, konkretno u ovom slučaju, umnožavanja DNK senkvence od interesa.
Da bi se zaista razumela genijalnost PCR metode treba znati par stvari, koje su same po sebi već opšte poznate.
Sve informacije o gradivnim elementima koji nas čine takvim kakvi jesmo su zapisane u našim genima, tačnije u našoj DNK.
DNK, iako nosi neverovatnu količinu informacija, je ispisana sa samo 4 različita nukleotida. Suštinski sve što čini naše telo i što mu osigurava funkcionisanje je napisano sa samo 4 slova. Kombinacije tih nukleotida, tačnije njihov redosled je osnovni element gena.
Šta to konkretno nama znači prilikom objašnjavanja pojma PCR i PCR analiza, pa još uvek ništa.
Da bi se to povezalo sa umnožavanjem treba se upoznati sa samom strukturom molekula DNK i time kako je upakovan i kako se prirodno umnožava.
Nukleotidi, slova kojima je kod ispisan, se redjaju u nizu i time sačinjavaju lanac, koji se zbog stabilnosti uvek pakuje u paru, dvolančano. To je omogućeno jedinstvenom osobinom nukleotida da se medjusobno privlače u tačno odredjenim parovima. Jedan nukleotid, slovo, će se uvek upariti sa tačno odredjenim drugim slovom i time će se osigurati ne samo stabilnost samih lanaca, neko i informacije koju nose.
Ovako upakovana DNK se skladišti u našim ćelijama. Kada se koristi, tačnije kada se koristi informacija koju nosi dvolančana struktura se mora razdvojiti na pojedinačne lance. Čisto zbog jednostavnog fizičkog pristupa nukleotidima od interesa.
Povezujući sada ovo sa našom orignalnom temom i pojmom PCR analiza, prilikom prirodnog umnožavanja DNK dešava se baš to. Lanci se prvo moraju razvojiti i onda se nukleotidi mogu neometano prepisati. U našim ćeljiama te procese će obaviti enzimi, nakon toga, lanci će se vratiti u svoju dvolačanu strukturu i sve će se vratiti na prvobitno stanje uz izuzetak umnoženog segmenta.
PCR reakcija reprodukuje baš te procese, samo u kontrolisanim uslovima i to je osnova svih PCR analiza.
Umesto enzima za razdvajanje lanaca koristi se povišena temperatura. Dok se za sam proces ugradjivanja nukleotida u novi lanac, prepisivanja sekvence, koristi termostabilni enzim, polimeraza.
Vratimo se sada na sam početak i reakcija lančane polimeraze zvuči značajno razumljivije, ali još uvek ne možemo reći da je pojam real time PCR analiza išta jasniji.
Dakle simuliranjem prirodnog umnožavanja sekvence mi možemo da umnožimo DNK lanac koliko god puta želimo. Ali DNK lanac je ispisan sa preko 3 milijade nukleotida, jednostavno moramo da znamo šta želimo da umnožimo.
Tu opet dolazi do izražaja genijalna osobina nukletoda da medjusobno privlače drugi tačno odredjen, komplementaran, nukleotid.
Prilikom umnožavanja prvi korak je uvek vezivanje početne, komplementarne sekvence za lanac koji će se prepisati. Možda je najbolje gledati na to kao da vam je neko dao da prepišete celu knjigu, ali vam je ispisao naslove, a vaše je da nastavite.
U ćelijama ovu bitnu ulogu obavljaju enzimi, a prilikom PCR reakcije mogućnost da birate naslove imate vi. Odabirom početne sekvence nukleotida birate i koji će se deo DNK lanca kopirati.
Sad već možemo reći da imamo dovoljno informacija da predpostavimo zašto je ova metoda toliko popularna. Pored toga što nam daje mogućnost da umnožimo segmente DNK, možemo i da biramo tačno koje sekvence želimo da umnožimo i kasnije proučimo.
Reakcija lančane polimeraze je jako bitno oružije svakog molekularnog biologa. Bilo koji živi organizam da istražuje, čak i za neke organizme za koje se ne može baš reći da su živi. Umnožavanjem željenog dela lanca dobijamo veliki broj kopija sekvence koju nameravamo da istražimo ili identifikujemo. Pravilnim odabirom prajmera, naslova za kopiranje, možemo precizno razlikovati gene, delove gena, varijante gena, itd.
Još samo fali element realnog vremena i možemo reći da u potpunosti razumemo ime i funkciju real time PCR-a.
To se sjajno nadovezuje na nastavak priče, pošto šta nam konkretno znači veliki broj kopija željene sekvence, svakako se neće videti golim oko, ili možda hoće.
Komponenta realnog vremena iz imena metode se odnosi na mogućnost posmatranja promena u realnom vremenu, uživo.
To se postiže dodavanjem fluorescentno obeleženih proba, kratkih sekvenci nukleotida, slova, koja koriste istu onu pojavu komplementarnosti da bi se vezali za ciljanu sekvencu i ugradili u novi lanac koji se sintetiše.
Probe ne emituju signal osim ako se ne vežu za ciljanu sekvencu, što bi značilo da ako nemaju za šta da se vežu neće biti signala, a ako imaju biće. Takodje što se više vežu, jači je signal.
Dakle, umnožavanjem željenje sekvence i ugradjivanjem fluorescentno obeleženih proba, koje se vezuju za još specifičnije sekvence nukleotida unutar ovih već umnoženih segmenata, dobijamo informaciju o samom sastavu lanaca, tačnije znamo koja se slova nalaze na pozicijama koje nas interesuju.
Pogledajmo sada, po poslednji put, sam početak teksta možemo li sada u jednoj rečenici odgovoriti na oba pitanja.